nyheder

I det seneste årti er gensekventeringsteknologi blevet meget anvendt i kræftforskning og klinisk praksis og er blevet et vigtigt værktøj til at afsløre kræfts molekylære karakteristika. Fremskridt inden for molekylær diagnose og målrettet terapi har fremmet udviklingen af ​​præcisionsterapikoncepter for tumorer og medført store ændringer inden for hele feltet tumordiagnose og -behandling. Genetisk testning kan bruges til at advare om kræftrisiko, vejlede behandlingsbeslutninger og evaluere prognose og er et vigtigt værktøj til at forbedre patienters kliniske resultater. Her opsummerer vi de seneste artikler, der er offentliggjort i CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol og andre tidsskrifter, for at gennemgå anvendelsen af ​​genetisk testning i kræftdiagnose og -behandling.

Somatiske mutationer og kimlinjemutationer. Generelt er kræft forårsaget af DNA-mutationer, der kan arves fra forældre (kimlinjemutationer) eller erhverves med alderen (somatiske mutationer). Kimlinjemutationer er til stede fra fødslen, og mutatoren bærer normalt mutationen i DNA'et i hver celle i kroppen og kan gives videre til afkom. Somatiske mutationer erhverves af individer i ikke-gametiske celler og gives normalt ikke videre til afkom. Både kimlinje- og somatiske mutationer kan ødelægge cellernes normale funktionelle aktivitet og føre til malign transformation af celler. Somatiske mutationer er en nøgledriver for malignitet og den mest prædiktive biomarkør inden for onkologi. Imidlertid bærer cirka 10 til 20 procent af tumorpatienter kimlinjemutationer, der øger deres kræftrisiko betydeligt, og nogle af disse mutationer er også terapeutiske.
Drivermutation og passagermutation. Ikke alle DNA-varianter påvirker cellefunktionen; i gennemsnit kræver det fem til ti genomiske begivenheder, kendt som "drivermutationer", at udløse normal celledegeneration. Drivermutationer forekommer ofte i gener, der er tæt forbundet med cellelivsaktiviteter, såsom gener involveret i cellevækstregulering, DNA-reparation, cellecykluskontrol og andre livsprocesser, og har potentiale til at blive brugt som terapeutiske mål. Det samlede antal mutationer i enhver kræftform er dog ret stort og spænder fra et par tusinde i nogle brystkræftformer til mere end 100.000 i nogle meget variable kolorektale og endometriekræftformer. De fleste mutationer har ingen eller begrænset biologisk betydning, selvom mutationen forekommer i den kodende region. Sådanne ubetydelige mutationsbegivenheder kaldes "passagermutationer". Hvis en genvariant i en bestemt tumortype forudsiger dens respons på eller resistens over for behandling, betragtes varianten som klinisk operabel.
Onkogener og tumorsuppressorgener. Gener, der ofte muteres i kræft, kan groft opdeles i to kategorier, onkogener og tumorsuppressorgener. I normale celler spiller proteinet kodet af onkogener hovedsageligt rollen med at fremme celleproliferation og hæmme celleapoptose, mens proteinet kodet af onkosuppressorgener hovedsageligt er ansvarlig for negativ regulering af celledeling for at opretholde normal cellefunktion. I den maligne transformationsproces fører genomisk mutation til en forøgelse af onkogenaktivitet og et fald eller tab af onkosuppressorgenaktivitet.
Lille variation og strukturel variation. Disse er de to hovedtyper af mutationer i genomet. Små varianter ændrer DNA ved at ændre, slette eller tilføje et lille antal baser, herunder baseindsættelse, deletion, frameshift, startkodon-tab, stopkodon-tabsmutationer osv. Strukturel variation er en stor genom-omlejring, der involverer gensegmenter, der varierer i størrelse fra et par tusinde baser til størstedelen af ​​kromosomet, herunder ændringer i genkopital, kromosomdeletion, duplikering, inversion eller translokation. Disse mutationer kan forårsage en reduktion eller forbedring af proteinfunktionen. Ud over ændringer på niveauet af individuelle gener er genomiske signaturer også en del af kliniske sekventeringsrapporter. Genomiske signaturer kan ses som komplekse mønstre af små og/eller strukturelle variationer, herunder tumormutationsbelastning (TMB), mikrosatellitinstabilitet (MSI) og homologe rekombinationsdefekter.

Klonal mutation og subklonal mutation. Klonale mutationer er til stede i alle tumorceller, er til stede ved diagnosetidspunktet og forbliver til stede efter behandlingens fremskridt. Derfor har klonale mutationer potentiale til at blive brugt som tumorterapeutiske mål. Subklonale mutationer er kun til stede i en delmængde af kræftceller og kan detekteres i begyndelsen af ​​diagnosen, men forsvinder ved efterfølgende recidiv eller optræder først efter behandling. Kræftheterogenitet refererer til tilstedeværelsen af ​​flere subklonale mutationer i en enkelt kræftform. Det er værd at bemærke, at langt de fleste klinisk signifikante drivermutationer i alle almindelige kræftarter er klonale mutationer og forbliver stabile gennem hele kræftprogressionen. Resistens, som ofte medieres af subkloner, detekteres muligvis ikke på diagnosetidspunktet, men optræder, når den får tilbagefald efter behandling.

Den traditionelle teknik FISH eller cellekaryotype bruges til at detektere ændringer på kromosomniveau. FISH kan bruges til at detektere genfusioner, deletioner og amplifikationer og betragtes som "guldstandarden" til detektering af sådanne varianter med høj nøjagtighed og følsomhed, men begrænset kapacitet. Ved nogle hæmatologiske maligniteter, især akut leukæmi, bruges karyotypning stadig til at vejlede diagnose og prognose, men denne teknik erstattes gradvist af målrettede molekylære assays såsom FISH, WGS og NGS.
Ændringer i individuelle gener kan detekteres ved PCR, både realtids-PCR og digital drop-PCR. Disse teknikker har høj følsomhed, er særligt velegnede til detektion og overvågning af små restlæsioner og kan opnå resultater på relativt kort tid. Ulempen er, at detektionsområdet er begrænset (normalt detekteres kun mutationer i et eller få gener), og muligheden for at udføre flere tests er begrænset.
Immunhistokemi (IHC) er et proteinbaseret overvågningsværktøj, der almindeligvis anvendes til at detektere ekspressionen af ​​biomarkører såsom ERBB2 (HER2) og østrogenreceptorer. IHC kan også bruges til at detektere specifikke muterede proteiner (såsom BRAF V600E) og specifikke genfusioner (såsom ALK-fusioner). Fordelen ved IHC er, at det let kan integreres i den rutinemæssige vævsanalyseproces, så det kan kombineres med andre tests. Derudover kan IHC give information om subcellulær proteinlokalisering. Ulemperne er begrænset skalerbarhed og høje organisatoriske krav.
Andengenerationssekventering (NGS) NGS bruger parallelle sekventeringsteknikker med høj kapacitet til at detektere variationer på DNA- og/eller RNA-niveau. Denne teknik kan bruges til at sekventere både hele genomet (WGS) og de interessante genregioner. WGS giver den mest omfattende information om genomiske mutationer, men der er mange hindringer for dens kliniske anvendelse, herunder behovet for friske tumorvævsprøver (WGS er endnu ikke egnet til analyse af formalin-immobiliserede prøver) og de høje omkostninger.
Målrettet NGS-sekventering omfatter hel exon-sekventering og et panel af målgenerne. Disse tests beriger interesseområder med DNA-prober eller PCR-amplifikation, hvilket begrænser den nødvendige mængde sekventering (hele exomet udgør 1 til 2 procent af genomet, og selv store paneler, der indeholder 500 gener, udgør kun 0,1 procent af genomet). Selvom hel exon-sekventering fungerer godt i formalinfikserede væv, er omkostningerne fortsat høje. Kombinationer af målgenerne er relativt økonomiske og giver fleksibilitet i udvælgelsen af ​​gener, der skal testes. Derudover er cirkulerende frit DNA (cfDNA) ved at blive en ny mulighed for genomisk analyse af kræftpatienter, kendt som flydende biopsier. Både kræftceller og normale celler kan frigive DNA i blodbanen, og det DNA, der udskilles fra kræftceller, kaldes cirkulerende tumor-DNA (ctDNA), som kan analyseres for at detektere potentielle mutationer i tumorceller.
Valget af test afhænger af det specifikke kliniske problem, der skal behandles. De fleste biomarkører forbundet med godkendte behandlinger kan detekteres ved hjælp af FISH-, IHC- og PCR-teknikker. Disse metoder er rimelige til detektion af små mængder biomarkører, men de forbedrer ikke detektionseffektiviteten med stigende gennemløb, og hvis der detekteres for mange biomarkører, er der muligvis ikke nok væv til detektion. I nogle specifikke kræftformer, såsom lungekræft, hvor vævsprøver er vanskelige at få, og der er flere biomarkører at teste for, er brugen af ​​NGS et bedre valg. Afslutningsvis afhænger valget af assay af antallet af biomarkører, der skal testes for hver patient, og antallet af patienter, der skal testes for biomarkøren. I nogle tilfælde er brugen af ​​IHC/FISH tilstrækkelig, især når målet er blevet identificeret, såsom detektion af østrogenreceptorer, progesteronreceptorer og ERBB2 hos brystkræftpatienter. Hvis der kræves en mere omfattende udforskning af genomiske mutationer og søgning efter potentielle terapeutiske mål, er NGS mere organiseret og omkostningseffektiv. Derudover kan NGS overvejes i tilfælde, hvor IHC/FISH-resultaterne er tvetydige eller ufyldestgørende.

Forskellige retningslinjer giver vejledning om, hvilke patienter der bør være berettigede til genetisk testning. I 2020 udstedte ESMO Precision Medicine Working Group de første anbefalinger til NGS-testning for patienter med fremskreden kræft, hvor de anbefalede rutinemæssig NGS-testning for fremskreden ikke-pladecellekræft, ikke-småcellet lungekræft, prostatakræft, kolorektal kræft, galdegangskræft og tumorprøver fra æggestokkræft, og i 2024 opdaterede ESMO på dette grundlag og anbefalede inkludering af brystkræft og sjældne tumorer, såsom gastrointestinale stromale tumorer, sarkomer, skjoldbruskkirtelkræft og kræft af ukendt oprindelse.
I 2022 fastslog ASCO's kliniske udtalelse om somatisk genomtestning hos patienter med metastatisk eller avanceret kræft, at hvis en biomarkørrelateret behandling godkendes til patienter med metastatiske eller avancerede solide tumorer, anbefales genetisk testning til disse patienter. For eksempel bør genomtestning udføres hos patienter med metastatisk melanom for at screene for BRAF V600E-mutationer, da RAF- og MEK-hæmmere er godkendt til denne indikation. Derudover bør genetisk testning også udføres, hvis der er en klar markør for resistens over for det lægemiddel, der skal administreres til patienten. Egfrmab er for eksempel ineffektivt ved KRAS-mutant kolorektal cancer. Når man overvejer en patients egnethed til gensekventering, bør patientens fysiske status, komorbiditeter og tumorstadie integreres, fordi den række af trin, der kræves til genomsekventering, herunder patientens samtykke, laboratoriebehandling og analyse af sekventeringsresultater, kræver, at patienten har tilstrækkelig fysisk kapacitet og forventet levetid.
Ud over somatiske mutationer bør nogle kræftformer også testes for kimlinjegener. Testning for kimlinjemutationer kan påvirke behandlingsbeslutninger for kræftformer såsom BRCA1- og BRCA2-mutationer i bryst-, æggestok-, prostata- og bugspytkirtelkræft. Kimlinjemutationer kan også have implikationer for fremtidig kræftscreening og forebyggelse hos patienter. Patienter, der potentielt er egnede til testning for kimlinjemutationer, skal opfylde visse betingelser, som involverer faktorer som kræfts arv i familien, alder ved diagnose og kræfttype. Mange patienter (op til 50%), der bærer patogene mutationer i kimlinjen, opfylder dog ikke traditionelle kriterier for testning for kimlinjemutationer baseret på familiehistorie. For at maksimere identifikationen af ​​mutationsbærere anbefaler National Comprehensive Cancer Network (NCCN) derfor, at alle eller de fleste patienter med bryst-, æggestok-, endometrie-, bugspytkirtel-, kolorektal- eller prostatakræft testes for kimlinjemutationer.
Med hensyn til tidspunktet for genetisk testning, er det rimeligt at udføre genetisk testning på patienter på tidspunktet for diagnosen af ​​fremskreden kræft, da langt de fleste klinisk signifikante drivermutationer er klonale og relativt stabile i løbet af kræftprogressionen. Til efterfølgende genetisk testning, især efter molekylær målrettet terapi, er ctDNA-testning mere fordelagtig end tumorvævs-DNA, fordi blod-DNA kan indeholde DNA fra alle tumorlæsioner, hvilket er mere befordrende for at indhente information om tumorheterogenitet.
Analyse af ctDNA efter behandling kan muligvis forudsige tumorrespons på behandling og identificere sygdomsprogression tidligere end standardbilleddannelsesmetoder. Der er dog ikke etableret protokoller for brug af disse data til at vejlede behandlingsbeslutninger, og ctDNA-analyse anbefales ikke, medmindre det er i kliniske forsøg. ctDNA kan også bruges til at vurdere små restlæsioner efter radikal tumorkirurgi. ctDNA-testning efter operation er en stærk indikator for efterfølgende sygdomsprogression og kan hjælpe med at bestemme, om en patient vil have gavn af adjuverende kemoterapi, men det anbefales stadig ikke at bruge ctDNA uden for kliniske forsøg til at vejlede beslutninger om adjuverende kemoterapi.

Databehandling Det første trin i genomsekventering er at udtrække DNA fra patientprøver, forberede biblioteker og generere rå sekventeringsdata. De rå data kræver yderligere behandling, herunder filtrering af data af lav kvalitet, sammenligning med referencegenomet, identifikation af forskellige typer mutationer gennem forskellige analytiske algoritmer, bestemmelse af effekten af ​​disse mutationer på proteintranslation og filtrering af kimlinjemutationer.
Driver-genannotation er designet til at skelne mellem driver- og passagermutationer. Drivermutationer fører til tab eller forstærkning af tumorsuppressorgenaktivitet. Små varianter, der fører til inaktivering af tumorsuppressorgener, omfatter nonsense-mutationer, frameshift-mutationer og nøgle-splejsningsstedsmutationer, samt mindre hyppig startkodondeletion, stopkodondeletion og en bred vifte af introninsertions-/deletionsmutationer. Derudover kan missense-mutationer og små introninsertions-/deletionsmutationer også føre til tab af tumorsuppressorgenaktivitet, når de påvirker vigtige funktionelle domæner. Strukturelle varianter, der fører til tab af tumorsuppressorgenaktivitet, omfatter delvis eller fuldstændig gendeletion og andre genomiske varianter, der fører til ødelæggelse af genlæserammen. Små varianter, der fører til forbedret funktion af onkogener, omfatter missense-mutationer og lejlighedsvise introninsertioner/deletioner, der er målrettet mod vigtige proteinfunktionelle domæner. I sjældne tilfælde kan proteintrunkering eller splejsningsstedsmutationer føre til aktivering af onkogener. Strukturelle variationer, der fører til onkogenaktivering, omfatter genfusion, gendeletion og genduplikering.
Klinisk fortolkning af genomisk variation vurderer den kliniske betydning af identificerede mutationer, dvs. deres potentielle diagnostiske, prognostiske eller terapeutiske værdi. Der findes adskillige evidensbaserede graderingssystemer, der kan bruges til at vejlede den kliniske fortolkning af genomisk variation.
Memorial Sloan-Kettering Cancer Centers Precision Medicine Oncology Database (OncoKB) klassificerer genvarianter i fire niveauer baseret på deres prædiktive værdi for lægemiddelbrug: Niveau 1/2, FDA-godkendte eller klinisk standard biomarkører, der forudsiger responset på en specifik indikation på et godkendt lægemiddel; Niveau 3, FDA-godkendte eller ikke-godkendte biomarkører, der forudsiger respons på nye målrettede lægemidler, der har vist lovende resultater i kliniske forsøg, og Niveau 4, ikke-FDA-godkendte biomarkører, der forudsiger respons på nye målrettede lægemidler, der har vist overbevisende biologisk evidens i kliniske forsøg. En femte undergruppe forbundet med behandlingsresistens blev tilføjet.
Retningslinjerne fra American Society for Molecular Pathology (AMP)/American Society of Clinical Oncology (ASCO)/College of American Pathologists (CAP) for fortolkning af somatisk variation opdeler somatisk variation i fire kategorier: Grad I, med stærk klinisk betydning; Grad II, med potentiel klinisk betydning; Grad III, ukendt klinisk betydning; Grad IV, ikke kendt for at være klinisk signifikant. Kun grad I- og II-varianter er værdifulde til behandlingsbeslutninger.
ESMOs Molecular Target Clinical Operability Scale (ESCAT) klassificerer genvarianter i seks niveauer: Niveau I, mål, der er egnede til rutinemæssig brug; Fase II, et mål, der stadig undersøges, vil sandsynligvis blive brugt til at screene den patientpopulation, der kan drage fordel af mållægemidlet, men der er behov for flere data til at understøtte det. Grad III, målrettede genvarianter, der har vist klinisk fordel hos andre kræftarter; Grad IV, kun målrettede genvarianter understøttet af præklinisk evidens; I grad V er der evidens, der understøtter den kliniske betydning af at målrette mutationen, men enkeltlægemiddelbehandling mod målet forlænger ikke overlevelsen, eller en kombinationsbehandlingsstrategi kan anvendes; Grad X, manglende klinisk værdi.